생체의 미토콘드리아 활성 조절 원리 분석시스템 개발 생명과학 한국연구재단 (2015-12-10 09:45) 한국연구재단(이사장 정민근)은 국내 연구진이 파킨슨병 등 퇴행성 신경질환의 원인으로 지목된 미토파지*의 활성 변화를 생체 조직에서 정확하게 측정할 수 있는 동물모델과 분석시스템을 개발했다고 밝혔다.   * 미토파지 : 손상되었거나 수명이 다한 미토콘드리아를 선택적으로 제거하는 세포 작용 동아대 의대 윤진호 교수는 미국 국립보건원 토렌 핀켈(Toren Finkel) 박사팀과 공동으로 생체조직 내의 손상된 미토콘드리아 분해 기전인 미토파지의 활성 변화를 측정하는 분석시스템 연구를 미래창조과학부와 한국연구재단이 지원하는 기초연구사업(선도연구센터지원)을 통해 수행하였으며, 연구결과는 Molecular Cell에 11월 19일자 대표논문(featured article)으로 온라인 게재되었다.논문명과 저자 정보는 다음과 같다.   - 논문명: Measuring in vivo mitophagic flux   - 저자 정보 : 윤진호 교수(제 1저자, 동아의대), 유영현 교수(공동저자, 동아의대), 토렌 핀켈(교신저자, 미국립보건원 책임연구원) 논문의 주요 내용은 다음과 같다.  1. 연구의 필요성   ○ ‘에너지 발전소’라 불리는 세포 속 미토콘드리아*의 활성 유지에 있어서 미토파지가 핵심적인 역할을 하는 것으로 밝혀지고, 미토파지의 활성 저하가 퇴행성 신경질환인 파키슨병의 원인으로 지목되면서 많은 연구가 집중되고 있다.    ○ 그러나 아직까지 생채 내 미토파지를 손쉽게 정량적으로 측정할 수 있는 연구기법이 개발되지 않아서 미토파지의 생체 내 기능과 분자 수준에서의 작동원리에 대한 연구는 이루어지지 못했다.      * 미토콘트리아 : 세포 내 소기관의 하나로 세포 호흡에 관여하여 에너지를 생산한다.   2. 발견 원리   ○ 본 연구팀은 일본 연구진에 의해 보고된 산호유래 형광 단백질인 케이마 단백질이 pH(수소이온농도)에 따라 변화하는 형광 특성*을 이용하여 미토콘드리아에만 발현되는 미토-케이마 단백질을 세포에서 발현시킨 후, 중성과 산성조건에서의 형광 신호를 통합 ? 분석하여 미토파지를 검출할 수 있는 영상 기반의 측정방법을 개발하였다.    * 형광특성 : pH 환경에 따라 단백질의 구조가 미세하게 변화하여 형광을 나타내는 성질이 달라지는 특성   ○ 모든 세포에서 미토-케이마 단백질이 발현되도록 유전적으로 조작한 형질전환 마우스(실험용 쥐)를 제작하고, 본 연구팀이 개발한 형광영상 분석기법을 이용해 세계 최초로 여러 생체조직의 미토파지를 측정하였다.    - 이를 통해 간, 심장, 근육, 뇌조직의 미토파지 활성이 모두 다르다는 것을 발견하였으며 노화에 따른 미토파지의 감소를 확인하였다. 또한 저산소 상태, 고칼로리 식이 등 환경변화에 따라서 미토파지 활성이 증가 또는 감소한다는 것을 확인하였다.    3. 연구 성과   ○ 미토파지 활성을 생체조직에서 매우 높은 감도로 실시간 측정할 수 있는 영상기반 분석기법을 개발하였으며, 미토-케이마 형질전환 마우스를 이용하여 생체 내 각 조직마다 미토파지 활성이 다르다는 사실과 노화에 따른 미토파지 활성 저하 및 환경적, 유전적 변화에 따라서도 미토파지 활성이 민감하게 변화한다는 것을 입증하였다.    ○ 본 연구를 통해 개발한 영상기반 분석시스템은 미토파지의 활성 변화 측정이 가능해 미토파지의 분자기전을 규명하기 위한 연구에 매우 유용할 것이며, 파킨슨병과 같은 퇴행성 신경질환 및 노화 질환의 원인 규명과 새로운 치료 방법 개발에 기여할 것으로 기대된다. 윤진호 교수는 “이번 연구를 통해 확립된 미토파지 분석시스템은 미토파지가 생체조직의 기능 유지와 인체 질병 발생에 있어서 어떤 역할을 하는지와 미토파지의 분자기전을 규명하기 위한 연구에 매우 유용하게 사용될 것”이라며, “향후 파킨슨병과 같은 퇴행성 신경질환과 노화 관련 질환 등의 원인규명 및 새로운 치료 방법 개발에 기여할 것으로 기대된다.”라고 연구의 의의를 밝혔다. 연 구 결 과  개 요 1. 연구배경  ㅇ 미토콘드리아는 에너지 생산, 대사 및 세포사멸의 중심 역할을 수행하는 세포 소기관의 하나이다. 생체 내 미토콘드리아의 활성은 새로운 미토콘드리아의 합성 및 수명을 다했거나 손상을 입은 미토콘드리아를 제거하는 미토파지 활성의 균형에 의해 유지된다. 손상된 미토콘드리아로부터 발생하는 활성산소는 노화의 주요 원인으로 여겨왔으며, 미토콘드리아 기능 이상은 당뇨병을 비롯한 여러 대사질환과 노화 관련 퇴행성 질환들과 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있다.   ㅇ 최근 미토파지의 활성 저해가 손상된 미토콘드리아의 축적을 야기하여 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환을 일으키는 주된 원인이라는 것이 밝혀지면서 미토파지 기전에 대한 학계의 관심이 크게 증가하고 있다. 그러나 많은 연구자들의 노력에도 불구하고 미토파지의 생체 내 역할과 그 분자기전은 여전히 정확히 밝혀지지 않았다. 그것은 생체 내 미토파지를 손쉽게 측정할 수 있는 연구기법의 부재가 가장 큰 걸림돌로 여겨져 왔다. 이러한 문제를 해결하기 위해 동아대학교 미토콘드리아 허브제어 연구센터 소속 윤진호 교수는 미국 NIH의 토렌 핀켈(Toren Finkel) 박사팀과의 공동연구를 통해 생체조직의 미토파지를 실시간 측정할 수 있는 마우스 모델과 미토파지를 정량적으로 분석할 수 있는 시스템을 개발하게 되었다. 2. 연구내용  ㅇ 미토파지는 미토콘드리아를 막으로 둘러싼 후 리소좀과 융합시켜 완전히 분해시킴으로써 손상되거나 불필요한 미토콘드리아를 효과적으로 제거할 수 있는 기전으로 평가된다. 본 연구에서는 최근 일본 연구팀에서 발견한 산호 유래 신규 형광단백질인 케이마 단백질을 활용하여 살아 있는 세포에서 미토파지를 실시간으로 측정할 수 있는 기법을 개발함으로써 생체조직의 미토파지 변화를 처음으로 측정하였다. 미토콘드리아는 미토파지 과정 중 리소좀과 융합되어 심한 산성환경에 노출되게 되는데 케이마 단백질이 pH에 따라 형광특성이 크게 변한다는 성질을 이용하여 미토콘드리아에서만 위치하도록 한 미토-케이마 단백질을 세포에 발현시킨 후 중성과 산성조건에서의 형광영상을 각각 기록하고 통합시킴으로써 미토파지에 의해 분해되고 있는 미토콘드리아를 현미경 영상에서 손쉽게 기록하고 정량화할 수 있는 영상 분석 방법을 확립하였다. 더불어 유세포분석기(flow cytometer)를 활용하여 미토파지를 매우 높은 감도로 정량화할 수 있는 기법도 개발하였다.   ㅇ 세포수준에서의 미토파지 분석법 개발성과를 바탕으로 미토-케이마 단백질을 발현하는 형질전환 마우스(의료용, 실험용 쥐)를 제작하고 형광영상 분석시스템을 이용하여 세계 최초로 여러 생체조직의 미토파지를 측정하는 데 성공하였다. 흥미롭게도 간, 심장, 근육, 뇌 등의 여러 조직의 미토파지 활성은 상당한 차이를 보였으며, 뇌의 경우는 부위별로 다른 활성을 나타내었다. 또한 이 형질전환 마우스를 사용하여 미토파지가 노화에 따라 감소한다는 사실을 발견하였다. 저산소 상태, 고칼로리 식이 등도 미토파지 활성을 변화시켰으며, 헌팅턴 유전자와 ATG7, ATG5 유전자들의 결손에 의해서도 미토파지 활성이 영향을 받음을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 생체조직의 미토파지 활성이 노화를 비롯한 여러 환경적 변화에 따라 민감하게 변화한다는 것을 최초로 규명하였다. 본 연구를 통해 수립된 미토-케이마를 발현하는 마우스 모델이 다양한 환경적, 유전적 요인에 따른 미토파지 활성 변화를 측정하는 데 매우 효과적인 연구모델임을 입증함으로써 향후 미토파지 연구에서 유용한 모델시스템으로 사용되어 미토파지 연구 분야 발전에 기여할 것으로 기대된다. 3. 기대효과  ㅇ 미토파지 이상이 파킨슨병의 원인으로 밝혀지면서 다양한 미토콘드리아 관련 질병 및 노화 관련 질병에서 미토파지가 어떤 역할을 하는지 규명하는 것이 매우 중요한 연구주제로 대두되고 있다. 또한 미토파지를 조절하는 핵심유전자와 분자신호경로를 규명하는 것 또한 미토파지 이상에 의한 질병발생을 이해하고 치료전략을 개발하는 데 필수적인 연구주제이다. 본 연구를 통해 개발된 미토-케이마 마우스 모델과 미토파지 측정시스템을 이러한 연구를 촉진시킬 것으로 기대된다. 더불어 미토파지 활성을 조절할 수 있는 제어수단을 개발하는 것에 있어서도 유용하게 활용할 수 있으며, 본 연구팀이 이와 같은 연구에 선도적인 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.  ★ 연구 이야기 ★ □ 연구를 시작한 계기나 배경은? 미토파지 이상이 파킨슨병의 원인으로 밝혀진 이후 미토파지에 대한 관심이 높아지고 있는 것에 반해 생체조직의 미토파지를 측정할 수 있는 손쉬운 방법이 없어 연구발전에 걸림돌이 되고 있다. 미토콘드리아 선도연구센터에서 연구를 하던 중에 미국립보건원으로 연구파견을 가게 되면서 새로운 미토파지 검출방법 개발 연구에 착수하게 되었다. 새로운 연구기법을 개발한다는 것은 성공을 보장할 수 없고, 많은 노력이 필요하다는 것을 잘 알고 있었지만 미토파지 연구분야에 큰 도움이 될 것이라는 생각에 연구를 시작하게 되었다. □ 연구 전개 과정에 대한 소개 때마침 일본 연구진에서 산호로부터 유래된 새로운 형광단백질인 케이마 단백질을 학계에 보고하여 이를 활용한 미토파지 검출시스템을 세포수준에서 먼저 확립하고자 하였다. 1년여의 노력 끝에 공초점현미경과 유세포분석기를 활용한 미토파지 검출기법을 확립할 수 있었으며, 이후 미토-케이마를 발현하는 형질전환 마우스를 제작하고 생체조직을 활용한 미토파지 활성측정과 여러 가지 환경적 변화에서 미토파지 활성이 어떻게 달라지는지 연구하였다.  □ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지? 생체조직의 형광영상을 분석하여 미토파지 활성을 측정하는 것은 그 누구도 시도하지 않았던 일이었기 때문에 스스로 해결해야만 하는 기술적인 문제들이 많았다. 물리광학을 전공한 현미경 전문가와 동물조직 분석 전문가 등 서로 전공분야가 다른 연구자들과 문제에 대하여 기탄없이 의견을 주고받으면서 혼자서는 생각할 수 없었던 새로운 시도들을 할 수 있었고, 그렇게 여러 문제들을 하나씩 해결할 수 있었다. □ 이번 성과, 무엇이 다른가? 미토파지를 검출할 수 있는 새로운 연구시스템을 사용하여 생체조직의 미토파지 활성을 최초로 측정하였다. 그 결과 생체조직별 및 기관별로 미토파지 활성이 상당히 다르며 환경적, 유전적 변화에 따라서도 미토파지 활성이 달라진다는 것으로 확인함으로써 새로운 검출방법이 미토파지 연구에 매우 효율적인 시스템임을 입증하였다. □ 꼭 이루고 싶은 목표와, 향후 연구계획은? 새로운 마우스 모델과 미토파지 검출시스템은 미토파지의 역할과 분자적 기전을 규명하는 것에 매우 유용하게 사용될 것으로 기대된다. 후속 연구를 통해 미토파지 분자기전을 규명하고 나아가 미토파지의 조절을 통한 질병치료 가능성을 확인하고 싶다. □ 기타 특별한 에피소드가 있었다면? 미토-케이마 마우스 모델을 만들어 처음 조직을 공초점현미경으로 관찰하던 날, 동료와 함께 환호성을 지르던 일이 지금도 기억난다. 새로운 연구기법을 개발하는 일이기에 여러 어려움이 많았지만 새로운 것을 연구한다는 기쁨과 생체조직 영상의 아름다움이 주는 놀라움이 그 모든 어려움들을 이기게 해주었다.   그림 1. 미토-케이마 형광단백질을 활용한 생체조직 미토파지 검출 시스템(A) 미토-케이마 동물모델에서 미토파지 검출원리 모식도. 미토파지의 결과로 미토콘드리아가 산성환경인 리소좀과 융합함에 따른 미토-케이마의 형광특성 변화를 분석하여 미토파지를 측정함을 묘사함. (B) pH에 따른 미토-케이마 단백질의 형광특성 변화. 중성 조선(pH7)에서는 짧은 파장(451nm) 레이저에 의한 형광이 강하나 산성조건(pH4)에서는 긴 파장(561nm) 레이저에 의한 형광이 강해짐. (C) 공초점현미경을 사용한 미토파지 측정 영상. 저산소조건(Hypoxia)에서는 미토파지가 증가하는 것이 붉은색 반점의 증가로 표시됨 (D) 유세포분석기를 사용한 발현세포의 미토파지 측정결과. 정상조건(Normoxia)에서는 미토파지가 활성화된 세포가 2.3%였으나 저산소조건에서는 48.3%로 증가하였음을 검출가능함.   그림 2. 미토-케이마 마우스를 활용한 생체조직의 미토파지 활성 측정(A) 미토-케이마 마우스는 정상 마우스와 외형적, 생리적으로 아무 차이가 없음. (B) 간세포에서 미토-케이마의 붉은색 형광신호가 리소좀 내에 융합된 미토콘드리아로부터 나옴을 확인함. (C) 다양한 조직의 미토파지 활성. 심장, 간, 신경세포, 흉선, 뇌 등 여러 조직의 미토파지 활성이 다양하며, 뇌의 여러 부위도 서로 다른 미토파지 활성을 가지고 있음을 확인함. 그림 3. 다양한 환경적, 유전적 변화에 따른 미토파지 활성변화 입증(A) 기억, 학습능력과 밀접한 연관이 있는 해마 부위의 미토파지 활성이 늙은 마우스에서는 현저히 감소함을 발견함. (B) 유전성 뇌질환인 헌팅턴의 원인 유전자인 헌팅턴 유전자 변이가 해마 부위의 미토파지를 현저히 감소시킴을 발견함. (C) 고지방식이를 섭취하였을 때 간의 미토파지 활성이 감소함을 확인함. (D) 저산소상태에서 간의 미토파지 증가를 확인함.