암 진단과 전이 가능성, 특정 단백질 양으로 간편 측정...고려대학교 김준 교수 연구팀 의학약학 한국연구재단 (2016-07-14 09:34) 암 세포의 악성 정도와 전이를 조기에 확인할 수 있는 단백질이 발견되었다. 한국연구재단은 미래창조과학부 기초연구사업(개인연구)의 지원을 받은 김 준 교수(고려대 생명과학부) 연구팀이“암 세포주의 전이와 악성이 심하면 특정 단백질이 세포 밖으로 분비되고, 정상세포에서는 분비되지 않는다는 사실을 발견했다.”고 밝혔다. 연구팀이 발견한 특정 단백질은 RPS3*.  RPS3단백질은 리보솜**을 구성하는 단백질 중 하나이며, DNA 손상복구효소***로도 작용하는 단백질로 알려져 있다. 지금까지는 단백질을 통해 그에 따른 특정 암을 예견할 수 있었으나, 여러 암 세포주를 토대로 리보솜 단백질이 세포 밖으로 분비된다는 사실은 이번에 처음 보고되었다.       * RPS3 단백질 : 리보솜의 작은 서브유닛의 구성 단백질로서 ribosomal small subunit protein 3의 약자이다.      ** 리보솜 (ribosome) : RNA와 단백질로 이루어진 복합체로서 세포질 속에서 단백질을 합성하는 역할을 하는 세포소기관     ***DNA 손상복구효소 (damage repair enzyme) : 손상받은 생체 DNA를 원상태로 복구해 주는 효소   연구팀은 인간 섬유육종, 피부 흑색소 세포종, 유방암 세포종을 비롯하여 쥐 배아 세포종, 쥐 호염기 백혈병으로부터 파생된 말초 혈관 세포 암세포주를 배양하여 세포 외부로 분비되는 단백질들을 분석하였다. 그 결과, 공통적으로 작은 리보솜을 구성하는 단백질 중 하나인 RPS3라는 단백질이 분비된다는 사실과 특별히 분비된 이 단백질은 RPS3를 구성하는 전체 아미노산 중 165번째에 위치하고 있는 아스파라긴 아미노산****이 당화 반응*****을 통해 변형이 되어야만 분비된다는 사실을 밝혔다.     **** 아스파라긴 아미노산 : 염기성을 띈 필수아미노산     ***** 당화(glycosylation) 반응 : 당을 단백질에 전위하는 반응   또한 당화 반응을 통해 세포 외부로 분비된 RPS3 단백질은 암세포주의 악성 정도에 비례하게 분비율이 증가한다는 사실을 확인했다. 이에 따라 생체 내에서 혈액으로 분비된 RPS3 단백질의 양을 조사함으로서 암 발생 가능성과 진행의 정도를 측정할 수 있는 표지로서의 활용 가능성이 제시되었다. 김 준 교수는 “이번 연구성과는 암 발생 가능성과 악성 정도를 혈액을 통해 간편히 측정하고 예측할 수 있는 단백질을 발견한 것이다. 암세포주 실험 단계를 넘어 암환자의 혈액에서 동일한 결과가 증명된다면 간편하게 암의 조기 진단이 가능해져 치료에 기여할 것으로 기대된다.”라고 연구의 의의를 설명했다. 이 연구성과는 저명 암 전문 국제학술지인 온코타겟(Oncotarget) 6월 22일자에 게재되었다.  논문의 주요 내용 □ 논문명, 저자정보 - 논문명 : Ribosomal protein S3 (rpS3) secreted from various cancer cells is N-linked glycosylated     - 저자 정보 : 김 준 (교신저자, 고려대), 김용중 (제1저자, 고려대학교 박사), 이민선 (공동저자, 고려대학교 석사), 김학동 (공동저자, 고려대학교 연구교수) □ 논문의 주요 내용  1. 연구의 필요성   ○ 암환자의 치료는 암세포의 발견 시기에 따라 생존률과 밀접하게 관련되어 있다. 또한 악성종양으로 발달하게 되고 전이가 이루어지게 되면 완치의 확률은 현저하게 떨어지게 된다.     ○ 어느 특정 암세포에서만 특징적으로 발현되는 단백질들은 현재까지도 꾸준한 연구를 통해 밝혀지고 있으나, 암환자의 수술을 통한 방법은 아직까지 많은 암치료의 주를 이루고 있는 상황이다.  2. 연구 내용    ○ 연구실 내에서 배양되어진 암세포주들 (인간 섬유육종, 피부 흑색소 세포종, 유방암 세포종을 비롯하여 쥐배아(胚芽) 세포종, 쥐 호염기 백혈병으로부터 파생된 말초 혈관 세포 암세포주)로부터 얻어진 배지를 고농축화하여 항원-항체 반응을 수행하였고, 이 중 발견된 RPS3 단백질*의 변형을 조사하기 위해 LC-MS/MS 분석*을 수행하였다.      ＊ RPS3 단백질 : 리보솜의 작은 서브유닛의 구성 단백질로서 ribosomal small subunit protein3의 약자      ＊ LC-MS/MS 분석 : 질량분석을 통한 액체 크로마토그래피       ○ LC-MS/MS 분석을 통해 분비되는 RPS3 단백질의 165번째 아스파라긴 아미노산이 당화 반응을 한다는 사실을 발견하였고, DNA 재조합기술을 통해 165번째 아미노산의 당화 반응을 억제시킨 세포에서 본 단백질의 분비가 사라짐을 확인함으로서, 단백질 분비에 있어서 필수적인 반응임을 알 수 있었다. 3. 연구 성과    ○ 이 연구에서 RPS3 단백질의 당화 반응을 억제시켰을 때 세포의 악성인 상태가 감소됨을 확인하였으며, 또한 암세포주의 전이 또한 감소함을 발견하였다. 암세포주의 전이 및 악성 정도에 따라 RPS3 단백질의 분비 정도 또한 비례하게 나타나는 것을 토대로 RPS3 단백질은 암세포주의 악성 상태를 표지할 수 있는 표지 단백질이라 할 수 있다.    ○ 더 나아가 환자의 혈액으로부터 당화 RPS3 단백질의 분비량을 측정하여 암환자의 암세포 전이 상태와 전이를 진단할 수 있을 것으로 기대한다.    ○ 암 환자의 혈액을 통해 RPS3 단백질뿐만 아니라 표지 단백질로 사용 가능한 다양한 단백질을 추출, 확인하여 더욱 정밀하게 암세포의 전이 및 진단을 가능하게 할 수 있을 것으로 기대한다.     ○ 향후 이 단백질에 대한 당화를 억제하면 암전이 및 치료가 가능한지의 여부는 세포수준에서 확인한 결과이므로 동물실험을 통해 재확인하여야 하며, 환자의 혈액시료의 임상 연구를 통하여 특정 암의 진단 여부를 추후 연구할 계획이다. 연 구 결 과  개 요  1. 연구배경  ㅇ 오늘날 인류를 가장 위협하는 질병 중 하나인 암을 정복하기 위해 치료법과 예방법등 여러 분야에서 연구가 활발히 진행되고 있다. 암이 진행이 되어 가면서 생체 내 여러 곳으로 전이가 되고 나면 어떠한 치료법도 환자를 살리는데 보장할 수 없음이 오늘 현실이다. 이러한 시대에 암의 전이 정도와 악성 정도를 손쉽고 빠르게 진단 및 측정할 수 있는 방법은 암 정복에 크게 한 발 내딛는 도약이 될 것이다.  2. 연구내용  ㅇ 연구팀은 다양한 암세포주를 배양하여 얻어진 배지에서 분비를 위한 단백질 변형인 당화 반응을 주목하였다. 이에 작은 리보솜 구성 단백질인 RPS3가 공통적으로 당화 반응 후 분비됨을 확인하였고, 전이 및 악성 암세포일수록 분비율이 증가함을 확인하였다. 이는 당화 반응을 억제시켰을 때 암세포주의 전이 및 악성 정도가 줄어듦으로서 암세포주의 전이 및 악성을 나타내는 표지 단백질로서의 활용 가능성을 확인하였다.    ㅇ 단백질이 세포 외부로 분비가 되기 위한 방법 중 하나인 당화 과정은 분비단백질을 전문적으로 연구함으로서 잘 알려진 사실이다. 본 연구팀은 수년 전에 당화 단백질만을 잡는 특정물질을 이용하여 RPS3 단백질이 당화됨을 확인한 바 있다. 또한 본 연구진에서는 이 단백질이 각종 암세포주 및 암환자 세포에서 과발현이 됨을 발견하였다. 당시 본 단백질의 기능을 더 이상 확인할 수 없었으나, 최근에는 여러 가지 실험 기법이 발달함에 따라 RPS3 단백질이 당화 과정을 거쳐 소포체(ER) 및 골지체(Golgi)를 통하여 세포 외부로 분비되는 단백질임을 형광현미경과 LC-MS/MS 크로마토그래피 분석법을 통하여 확인이 가능하였다. 또한 유전자조작법을 통하여 당화과정을 위한 아미노산 위치를 확인할 수 있었고, 그에 따른 기능은 세포의 전이 및 악성 종양의 특성인 세포의 이주 속도를 측정할 수 있는 상처 치료 복구 방법(wound-healing assay*) 과 세포의 특이 형태를 관찰할 수 있는 3D 배양법**을 확인함으로서 증명할 수 있었다.         *상처 치료 복구법 (wound-healing assay) : 세포 배양 시 세포 배양 용기에 흔적을 남겨 세포들에 의해서 흔적이 복구되는 시간을 측정함으로서 세포의 이동 속도를 비교하는 실험기법         **3D 배양법 : 겔(gel) 상태에서 세포를 배양한 후 이를 현미경을 통해 관찰하여 세포의 특이적인 모양을 관찰하는 실험 기법 3. 기대효과  ㅇ 연구실 내의 다양한 암세포주에서 분비되는 특정 단백질의 당화 반응은 환자 혈액에서의 동일한 현상을 확인할 필요가 있다. 이 후 혈액 내로 분비되는 당화된 RPS3 단백질과 암환자의 암 전이 및 악성 정도가 확립이 된다면 암 환자의 암세포 전이 단계 및 악성 정도를 극소량의 혈액 샘플만으로 단시간에 측정 및 진단할 수 있을 것이다.  ㅇ 뿐만 아니라 다양한 암세포주에서 암세포의 전이 및 악성 정도를 특징지을 수 있는 다양한 단백질들을 발굴해 낸다면 더욱 정확한 암세포의 전이와 악성 정도의 진단 및 측정이 가능해질 것이다. ★ 연구 이야기 ★ □ 연구를 시작한 계기나 배경은? 본 연구팀은 사실 작은 리보솜 구성 단백질 중 하나인 RPS3 의 기능을 전문적으로 연구하는 팀이다. 수년전 S3 단백질이 DNA 손상복구효로로 작용함을 밝혔으며, 또한 암전이 억제 단백질 중 하나인 nm23-H1 과 상호작용을 하여 암전이에 영향을 미친다는 사실을 발견하였었고, 이후 암 전이와 본 단백질의 관계를 규명하기 위해 노력해 왔다. □ 연구 전개 과정에 대한 소개 이전에 본 연구팀에서 보고한 바 있는 암전이 억제 단백질과 상호 작용을 하여 암세포의 전이를 억제시킨다는 사실을 확인한 바 있어, 이 단백질이 암전이와 관계가 있음을 알게 되었고, 따라서 본 연구팀에서는 이 메커니즘을 밝히고자 노력하였고  RPS3 단백질의 세포내 기능과 세포 밖으로 분비되었을 때 본 단백질은 당화 반응을 거치게 된다는 사실에 새로운 사실을 발견하게 되었다. □ 연구하면서 어려웠던 점이나 장애요소가 있었다면 무엇인지? 어떻게 극복(해결)하였는지? 분비되는 단백질의 규명은 여러 가지 극복해야 하는 문제점들이 존재한다. 단순히 세포가 터지면서 (자살-apoptosis 이나 괴사-necrosis를 통해) 세포 밖으로 흘러나온 것이 아닌, 세포 내 어떤 메커니즘을 통한 의미있는 경로를 통해야만 분비라 명할 수 있기 때문이다. 이를 증명하기 위하여 우리는 당화 반응을 확인할 수 있었고, 이는 명백한 세포내 소포체-골지체 경로를 통한 의미 있는 분비 과정이라 확인하였다. 가장 큰 문제점이자 해결해 나가야 할 점은 연구실내의 결과를 임상에 적용하는 과정일 것이다. 본 연구팀의 이번 발견을 암 전이 및 악성 조기 진단의 가능성으로 정의한다면, 환자 혈액 내에서 동일한 현상을 증명함은 암 조기진단의 새로운 가능성으로 정의할 수 있을 것이다. □ 이번 성과, 무엇이 다른가? 지금까지 와의 다른 점은 특정 암에서의 특정 단백질로 대표할 수 있는 표지 단백질 발굴에서 본 연구팀의 다양한 암세포 주를 통합하여 동일한 단백질의 변형과 전이 및 악성 정도에 비례한 분비를 확인하여 응용할 수 있다는 것이며, 또한 본 연구를 토대로 또 다른 암 전이 및 악성 정도를 대표할 수 있는 다양한 표지 단백질을 발굴할 수 있는 기초를 확보했다는 데 있을 것이다. □ 꼭 이루고 싶은 목표와 향후 연구계획은? 본 연구팀은 이번에 확인된 RPS3의 당화 반응을 감지할 수 있는 항체를 개발 중에 있으며, 암환자의 혈액 내에서 동일한 현상을 확인하기 위한 협력을 기다리고 있는 중이다. 이 항체가 개발 완료가 되어 환자 혈액 내에서 RPS3 단백질의 당화 반응의 현상이 동일하게 증명이 되어 암전이 및 악성 정도와 RPS3 단백질의 분비율이 정립되면, 암으로 의심되는 환자의 극소량의 혈액만으로 암을 진단할 수 있을 것이며, 전이 정도의 지표를 만들 수 있을 것으로 기대한다. □ 기타 특별한 에피소드가 있었다면? 한 때 이전 발견과 상반되는 결과로 연구실내에서 고민을 많이 한 적이 있었다. 이는 둘 중 하나는 분명 잘못된 결과가 아닌가하는 편협된 생각이었지만, 생명을 갖는 모든 생명체에서는 어떠한 상황도 100%라는 것은 없다는 결론을 받아 들일 수밖에 없는 결과이다. 가장 작은 단위인 세포에서조차도 우리는 우리의 지식이 얼마나 제한적이며 한정된 것인지를 알게 되고 한없이 겸손하게 되는 결과였다. (그림 1). 세포 내 소포체-골지체(ER-Golgi) 분비경로를 저지시키는 화합물인 브레펠딘(Brefeldin) A(BFA) 처리 후 작은 리보솜 단백질 S3 (RPS3) 와 소포체 (ER)         해당 단백질을 만났을 시 녹색을 띄는 RPS3 단백질 항체와 소포체(ER)에 특이적으로 붙어 붉은 색을 띄는 항체를 사용하여 각각 지시하는 부분을 형광현미경으로 확인하였다. 그림1 은 세포의 분비과정 중 하나인 ER 에서 Golgi 로의 경로를 억제시켰을 때 (BFA+) 억제되지 않은 상태 (BFA-)에 비하여 RPS3 단백질(녹색)의 분비 과정 중 ER(붉은색)에서 저지되어 겹쳐진 사진에서 노란색을 보임으로서 RPS3 단백질이 ER을 통한 분비 과정이 이루어짐을 알 수 있다.  (그림 2) 암세포주의 전이율 측정 실험  세포 내에 정상 RPS3 단백질을 과발현 시켰을 때 (FLAG-rpS3) 와 당화 반응을 억제시킨 RPS3 단백질을 과발현시켰을 때 (FLAG_N165G) 암세포주의 전이율을 비교하였다. 16시간 후 (16hr) 당화 반응을 억제시킨 RPS3 단백질은 대조군에 비하여 전이율이 현저히 떨어져 있음을 확인하였다. 이는 암세포의 전이력을 설명할 수 있는 실험이다. (그림 3) 암세포의 악성화를 확인할 수 있는 세포형태 측정 실험세포 내에 정상 RPS3 단백질을 과발현 시켰을 때 (FLAG-rpS3) 와 당화 반응을 억제시킨 RPS3 단백질을 과발현 시켰을 때 (FLAG_N165G) 암세포주의 악성화 형태를 비교하였다. 당화 반응을 억제시킨 S3 단백질은 대조군에 비하여 암세포의 악성화 형태를 설명할 수 있는 돌출부가 사라짐을 확인하였다. 이는 암세포의 악성 정도를 설명할 수 있는 실험이다. http://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=274019&Page=1&SOURCE=6